微生物验证3篇

1.适用范围

本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。

2.目的

通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定。

3.职责

项目责任人：负责验证方案的起草及具体实施。

验证管理员：负责验证工作的组织、协调及管理。

QA现场监控员：负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。

QC负责人：负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执

行，负责组织实施。

QC检验员：负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。

质量部经理：负责验证方案及报告的审核和批准。

4.内容

4.1.概述

通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建

立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。

4.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。.验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

4.2.1.验证用菌株及菌种要求

大肠埃希菌【CMCC（B）44102】、金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】、黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。

大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，前述菌株作为细菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌及酵母菌计数验证用菌株。

验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采

用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

4.2.2.验证菌菌液制备

.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备：接种大肠埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基中，35～37℃培养18～24小时。取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6~10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu

的菌悬液。

.白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6~

10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。

.接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，吸至无菌试管内，取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍

递增稀释法，稀释至10-4~10-6，制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

4.2.3.供试液的制备

.无抑菌活性的供试品供试液的制备

◆稀释剂：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液

◆液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加入90ml稀释剂，混匀，作为供试液（1：10）。

◆固体、半固体、粘稠性供试品供试品：称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，

作为供试液（1：10）。

.具有抑菌活性的供试品供试液的制备

当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下：

◆培养基稀释法：取供试液2ml，每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。计算每1ml供试液的平均菌落数，

按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时可加大增菌液的用量。

◆离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分钟离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。

◆薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，按薄膜过滤法测定其菌落

数。

◆中和法：选取适宜的中和剂如磺胺类药物加入适当的对氨基苯甲酸，含重金属的药物在培养基内加入巯基化合物如硫乙醇酸钠-半胱氨酸，洗必泰制剂加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%），卤素中

加入硫代硫酸钠（0.1%）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性后测定。

4.2.4.菌液组测定所加的试验菌数。采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50～100cfu）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

4.2.5.试验组

.平皿法：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，

立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

.培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液分别注入N个平皿中，每个平皿再注入50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，

按平皿法测定其菌落数。

薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液

中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌落数。至少要一张膜。

.离心沉淀集菌法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心3~5分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1ml液体，并用稀释剂

洗涤管底，将洗涤液与1ml液体一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。

4.2.6.供试品对照组

取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数（方法和试验组相同）。

4.2.7.稀释剂对照组

若供试液需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤法等处理时，应增加稀释剂对照组，用稀释剂代替供试品，加入试验菌，使最终浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和计数

方法计数。

4.2.8.回收率计算

.试验组回收率计算

试验组的菌回收率＝试验组的菌回收率—供试品对照组平均菌落数×100%

菌液组的平均菌落数

.稀释剂对照组回收率计算

试验组的菌回收率＝稀释剂对照组平均菌落数×100%

菌液组的平均菌落数

计数方法验证至少应进行3次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

4.2.8.结果判断

在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）≥70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）≥70%。照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，使试验组菌回收率大于70%。

4.3.控制菌检验方法验证

当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的的控制菌检查方法测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应进行

重新验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

4.3.1.验证用菌株

大肠埃希菌（Esherichiacoli）【CMCC(B)44102】、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）【CMCC(B)003】、乙型付伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）【CMCC(B)50094】、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）【CMCC(B)10104】

验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

4.3.2.菌液制备

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时；分别取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，制成每1ml含菌数10～100cfu的菌悬液。

4.3.3.阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。

4.3.4.试验组

.常规法

◆大肠埃希菌取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时，取此培养物按《微生物限度检查SOP》大肠埃希菌项下规定检查。

◆大肠菌群取含适量（不少于10ml）的`胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入含供试品1g或1ml、0.1g或0.1ml、含供试品0.001g或0.001ml的供试液，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时，按《微生物限度检查SOP》大肠菌群项下规定检查。

◆沙门菌取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，阳性菌对照加入沙门菌10～100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时。按《微生物限度检查SOP》沙门菌项下规定检查。

◆铜绿假单胞菌取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入铜绿假单胞菌10～100cfu，阴性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时。按《微生物限度检查SOP》沙门菌项下规定检查。

◆金黄色葡萄球菌取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，阴性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时。

按《微生物限度检查SOP》金黄色葡萄球菌项下规定检查。

.培养基稀释法供试品有抑菌作用，放大培养基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器体积限制，一般放大到500ml或1000ml，本法适用于抑菌作用不强的样品。

.薄膜过滤法采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

.离心沉淀集菌法取规定量供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心3~5分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1ml液体，并将适量的稀释剂洗涤管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养，本法适用于中度抑菌作用的样品。

.中和法在供试品溶液中加入相应的中和剂，以减除供试品中抑菌成分的作用，中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成分结合后的产物应对微生物亦无毒性，或有毒性但不影响待检菌的检出。

4.3.5.结果判断

至少应进行3次独立平行试验。阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌的检查；若试验组未检出试验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

5.验证的实施

5.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证记录及控制菌检验方法验证记录(见附件)。

5.2.分析数据，综合整个验证过程，得出验证结论。

5.3.验证过程中发生的异常情况，按照《偏差处理程序》进行处理。

6.相关文件

《微生物限度检查SOP》

XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案

1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。

2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。

3.判定标准

3.1验证小组成员

3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。

3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。

3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。

4.验证方法

4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物

4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。

4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIIIC）配制；0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。

4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。

4.1.5验证用微生物名称及编号

4.1.6菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。4.1.7供试品溶液的制备称取XXXX软膏10g，置灭菌三角瓶中，加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，45℃下使之全部溶化，摇匀，作为1：10的供试品溶液。4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容

4.2.1试验组：分别取1:10供试品

溶液0.2ml注入两个平皿，接种50-100个挑战微生物，每株试验菌平两行制备两个平皿（分别注入以上四种菌悬液），向平皿内倒冷却至45℃的营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌霉）15～20ml：并混合均匀凝固后，置于所需温度下培养。

4.2.2菌液组：不加供试液，直接将试验菌株接种于2个平皿中，其余操作步骤同样品试验组操作。

4.2.3供试品对照组：取1:10供试品溶液0.2ml分别注入两个平皿，向平皿内倒冷却到45℃的营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌霉）15～20ml,并混合均匀凝固后，置于所需温度下培养。

4.2.4上述操作，应做三次平行试验，分别计算各次试验的菌的回收率。

试验组的菌回收率=[(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数]×100%。

4.2.5培养：营养琼脂培养基平皿倒置于30-35℃下培养48h，玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出

概述

1.1试验背景

为保证微生物限度检验结果的准确可靠，当建立产品的微生物限度检查法时，应进行方法的试验，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，所采用的方法适合于该产品的微生物限度检查。按照《中国药典》2015年版要求，检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，检查方法应进行重新试验。

根据15年版药典及药品微生物实验室质量管理指导原则要求，检测环境由原来的为C级背景下局部A级空气单向流，变更为在C级背景下，生物安全柜中进行微生物限度检测,试验用菌株有原来的大肠埃希菌变更为铜绿假单胞菌、接种用培养基随之发生变化；实验组及对照组制备发生变更。现针对纯化水微生物限度试验方法确认，以证明所采用的方法适合该药品的微生物限度检查。

1.2方案说明

验证过程中严格按照经批准的方案规定的内容进行，若因特殊原因需要变更时，应填写方案变更申请及批准书（附件1），报验证领导小组批准。

2.试验目的及要求

按照《中国药典》2015年版规定对纯化水微生物限度检查方法进行试验，在现有检验程序、检测条件及培养条件下，通过试验以确认所采用的方法适合于纯化水需氧菌的测定；根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据试验结果判断是否符合试验标准。

3.试验小组

4.风险分析:

4.1风险等级标准

A、严重程度（S）：测定风险的潜在后果，主要针对可能危害产品质量、患者健康及数据完整性的影响，分为以下四级：

B、可能性程度(P)：测定风险产生的可能性，为建立统一基线，建立以下四个等级：

C、检测能力（D）:在潜在风险造成危害前，检测发现的可能性，设为以下四个等级：

4.2风险评估：根据确定的风险标准对已经识别并分析的风险进行评价，即通过评价风险的严重性和可能性从而确认风险的等级。质量风险优先级别评价标准如下：

风险优先系数（RPN）计算：严重程度（S）×可能性程度(P)×检测能力（D）。

4.2.1风险识别

1)产品组分或组成发生改变2)检验程序与检验条件发生改变

3)产品存在抗菌活性，抗菌活性的去除影响微生物的生长4)微生物检验用物料影响检验结果4.2.2风险分析及评价

4.3依据风险分析及评价结果需实施的确认项目

5.试验前准备

5.1文件确认

5.2.仪器确认：·

5.2.1确认检测设备已经检定并在有效期内使用。5.2.2确认检测设备运行良好，且满足检测需要。

5.3培养基和冲洗液的确认

5.3.1确认培养基是否在有效期内使用5.3.2确认培养基储存条件、性状符合要求。

5.4试验用菌株及菌种要求

6.试验步骤

6.1.需氧菌计数

6.1.1.菌液制备

1）铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液制备：接种铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌工作用菌种1白金耳接种至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时。取该新鲜培养液1ml加入至0.9%无菌氯化钠溶液中（规格：9ml/支），10倍梯度稀释至10～10，制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液。试验步骤：

6.1.2.供试液的制备

供试品：纯化水储存条件：；

取样点1：；取样点2：；取样点3：；稀释剂：0.1%蛋白胨水溶液方法：试验组：

A）灭菌吸管吸取5ml供试品加入电动吸引器滤杯中，加入无菌0.1%蛋白胨水溶液50ml进

行过滤，滤干后，将薄膜用镊子夹到已凝固的R2A琼脂培养基上。每个样品做两个平行样。

B）供试品对照组：取制备好的供试液,以稀释液代替菌液同试验组操作。

C）菌液对照组：取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

D）计数方法适用性试验进行3次独立平行试验（分别使用不同取样点的纯化水），并分别计算各试验菌每次回收试验的比值。可接受标准：

试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。

计数结果（CFU/皿）：