分子实验[优秀范文]

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一、实验目的

1、学习与掌握利用ITS序列鉴定真菌的原理；

2、掌握用ITS序列鉴定真菌的方法有步骤。

二、实验原理

1、菌物是真核生物的重要类别，传统的菌物分类以子实体形态特征和生理生化指标为分类基础，由于部分菌物的子实体不易获得，形态特征不易掌握，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，是传统的菌物鉴定工作困难或分类系统意见分歧。内转录间隔区ITS(internal transcribed space),位于5.8S和18S之间（ITS1）以及5.8S和28SrDNA之间(ITS2)，ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8SRNA基因也被包括在ITS之内。近年来，利用真核生物在rDNA的ITS区域既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR扩增、测序。随着核糖体rDNA ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息得到阐明。

2、ITS（Internal Transcribed Spacer）：内转录间隔区。是真菌核糖体RNA（rRNA）基因非转录区的一部分。用于真菌鉴定的ITS序列通常包括ITS1、5.8 S和ITS2。真菌ITS区域长度一般在650～750 bp(碱基对)。

ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。

ITS鉴定的原理：rDNA上的5.8、18和28 SrRNA基因有极大的保守性,即存在着广泛的异种同源性。而由于ITS区不加入成熟核糖体,所以ITS片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小,因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性,即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异,显示最近的进化特征。研究表明,ITS片段的进化速率是18 S rDNA的10倍。这就是ITS序列在微生物种类鉴定和群落分析的理论基础。ITS1和ITS2是中度保守区域,其保守性基本上表现为种内相对一致,种间差异比较明显。这种特点使ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。由于ITS的序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异,此外ITS序列片段较小、易于分析,目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中。ITS的序列分析还有效地解决Lenti nul a、Suill us、Tuber、Cer at ocystis和Oi diodendron等真菌应用形态学特征进行分类所引起的纷争,弥补了传统分类上的一些不足。

ITS 鉴定的方法学：真菌rDNA ITS序列分析用于真菌系统分类通常通过多聚酶链式反应(PCR)技术实现。rDNA多复制的特性,有利于低浓度或被更高度降解的DNA样品中ITS区域的扩增。这有利于研究尚无任何rDNA序列资料的生物。根据这些基因上高度保守区段设计出通用引物,借助PCR技术扩增rDNA的目的片段。PCR技术在真菌分类、鉴定中与直接测序法相结合有很大的优越性[ 14] : ①只需少量的DNA,每次扩增只需约0.1～10 ng;②可对DNA的2条链测序,从而减少错误;③可利用总DNA的较粗制备品;④适合于自动测序仪进行测序。

三、实验器材

1、真菌总基因组DNA的提取及其纯度、浓度的检测：

1)、仪器：离心机离心管移液枪(200μL、1000μL)枪头研钵恒温水浴锅超净工作台琼脂糖凝胶电泳系统一次性手套凝胶成像系统

紫外分光光度计

2)、材料：真菌3)、试剂：

(1)、DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS

(2)、3M NaAc

(3)、TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA

(4)、酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)

(5)、氯仿:异戊醇(24:1)(6)、异丙醇

(7)、无水乙醇

(8)、75%乙醇

(9)、加入巯基乙醇(10)、RNaseA

2、ITS片段的PCR扩增及其产物电泳检测：

1)、仪器：PCR热循环仪琼脂糖凝胶电泳系统移液枪一次性手套2)、材料：真菌ITS片段3)、试剂：

（1）、引物：ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’(5’端引物)ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’(3’端引物)

（2）、ddH2O(2.5mM)

（3）、10×MgCl2缓冲液

（4）、DNA模板

（5）、脱氧核糖核酸聚合酶(Taq酶)

（6）、50×TAE贮存液

（7）、6×加样缓冲液

（8）、100bpDNA ladder。

(9)、溴酚蓝染料

3、ITS片段测序

1)、仪器：PCR热循环仪高压电泳仪测序用电泳槽制胶设备吸头、与电泳玻璃相配的染色盘、小指管

2)、材料：ITS片段PCR扩增产物3)、试剂：

药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris）乙二胺四乙酸(EDTA)硼酸尿素丙烯酰胺N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）过硫酸铵冰乙酸碳酸钠（Na2CO3）甲醛硫代硫酸钠硝酸银（AgNO3）测序级Taq DNA聚合酶4种d/ddNTP混合液pGEM-3ZF(+)对照DNA 1μg/μL ITS4/ITS5正向引物粘合硅烷硅烷

溶液：

（1）、5×TBE：

Tris 13.5g硼酸6.9g EDTA 0.9g用双蒸水定容至250mL

（2）、6%变性聚丙烯酰胺凝胶贮液：

尿素

63.06g

丙烯酰胺8.5g

N，N’-亚甲基双丙烯酰胺0.45g 5×TBE 15mL用双蒸水定容至150mL（用普通滤纸过滤后使用）。

4、BLAST比对、鉴定属、种：

仪器：电脑及携带BLAST程序（基本局部相似性比对搜索工具）

5、进化树的绘制

仪器：电脑及携带MEGA软件（分子进化遗传分析）

四、实验内容及步骤

(一)、实验内容：

1、大量真菌的准备;

2、真菌总基因组DNA的提取；

3、真菌基因组DNA纯度、浓度的检测；

4、ITS片段的PCR扩增；

5、ITS片段的PCR扩增产物电泳检测；

6、ITS片段测序；

7、BLAST比对、鉴定属、种。

(二)、实验步骤：

1、真菌总基因组DNA的提取及其纯度、浓度的检测：

（1）、准备大量的真菌，然后去1g真菌，在液氮中迅速研磨成粉。

（2）、2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热；

(3)、在1.5mL离心管中加入65℃预热的抽提液700μL。

(4)、加入巯基乙醇50μL，上下震荡，使蛋白质变性沉淀，65℃水浴40min，每隔10min振荡混匀一次。

(5)、加入等体积（约750μL）的氯仿/异戊醇(24/1)混匀，除去蛋白质，4℃平衡离心，10000rpm，10min。(6)、取上清（约750μL）到1.5mL离心管中，加1/5体积（约150μL）65℃预热的CTAB/NaCl混匀，加入600μL的氯仿/异戊醇(24/1)混匀，4℃平衡离心，10000rpm，10min。

(7)、取上清，加等体积（约750μL）的CTAB沉淀液，颠倒混匀。65℃水浴30min至沉淀可见。4℃平衡离心，10000 rpm，10min后小心去上清。

(8)、沉淀用TE（0.5mL）溶解，加入等体积（约0.5mL）的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提，4℃平衡离心，10000rpm，10min。

(9)、取上清加入2倍体积的无水乙醇（1mL），再加入1/10体积的NaAC（pH 5.2）约0.1mL。

(10)、-20℃冰箱1h，4℃平衡离心，12000rpm，10min，弃上清，用70%酒精清洗2次，滤纸吸去多余水分，超净台吹干。

(11)、0.05mL TE溶解，加入5μLRNA酶液37℃放置30min；(12)、吸取适量样品于紫外分光光度计上检测浓度与纯度；

(13)、剩余的样品置于-20℃保存待用。

2、ITS片段的PCR扩增及其产物电泳检测

ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’

1)、PCR Amplification reaction system（PCR扩增反应体系）（50μl）ddH2O 38.5μl 10×buffer with MgCl2(MgCl2缓冲液)5.0μl dNTPs(2.5mM)1.0μl Primer5’（5’端引物）2.0μl Primer3’（3’端引物）2.0μl DNA template（DNA模板）1.0μl Taq DNA polymerase(脱氧核糖核酸聚合酶)(5U/μl)0.5μl

2)、反应程序如下：

（1）94℃ for 5 minutes denaturalization（94℃预变性5min）

（2）94℃ for 45 seconds denaturation（94℃变性45s）

（3）52℃ for 45 seconds annealing(52℃退火45s)

（4）72℃ for 1min30sec extension（72℃延伸90s）重复步骤(2)-(4)30次

（5）72℃ for 10 minutes final extension（72℃最后一次延伸10min）大概500bp左右

3)、取5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，其余-20℃保存：

(1)、琼脂糖凝胶：将50×TAE贮存液用蒸馏水稀释成1×TEA电泳缓冲液，待用，按1%称取适量琼脂糖置于250mL锥形瓶中，加入对应量1×TEA稀释缓冲液，盖上封口膜，以减少水分蒸发，放入微波炉里加热沸腾，取出摇匀，使瓶壁上粘附的琼脂糖全部溶解，反复3次，至琼脂糖全部溶化，放置，待其稍冷却。

(2)、胶板的制备：将制胶槽置于水平支持物上，选择合适厚度和齿数的样品梳，插上梳子。向冷却至50-60℃的琼脂糖凝胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液数滴，摇匀，小心地倒入制胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后，小心拔出梳子，将胶块取出，至于已加入足量1×TEA电泳缓冲液的电泳槽内。

(4)、加样：取5μl样品与2μl 6×加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加样品槽中，在第一个孔或最后一个上样孔内加入5μl的100bpDNA ladder。

(5)、电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，以5V/cm(约100V)电泳，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

(6)、成像：戴上一次性手套，在波长为254nm的紫外灯下观察胶块，DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带，用凝胶成像系统照相。

3、ITS片段测序

（一）测序反应：

1.对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)石蜡油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。

2.对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂：

（1）样品反应：

质粒模板DNA 2.1pmol 5×测序缓冲液5ml引物4.5pmol无菌ddH2O至终体积16ml

（2）对照反应

pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg)4.0ml

5×测序缓冲液5ml

ITS4/ITS5正向引物(4.5pmol)3.6ml

无菌ddH2 O至终体积16 ml

3.在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。

4.从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。

5.在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。

6.把G、A、T、C 4个反应管放入预热至95℃的热循环仪，先经过95℃ 2min，然后进入如下循环：

95℃ 30s变性42℃ 30s退火70℃ 1min延伸45-60个循环后，取出置于冰箱中

7.热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。

（二）、测序凝胶板的制备

1、玻璃板的处理：

（1）短玻璃板的处理

A.在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane),配成新鲜的粘合溶液。

B.用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板,整个板面都必须擦拭。

C.4-5分钟后,用95%乙醇单向擦玻璃板,然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程,每次均须换用干净的纸,除去多余的粘合溶液。

2、长版处理（换双橡胶手套）

(1)、用浸透硅烷的吸水纸仔细擦边玻璃板表面。

(2)、5-10min后，用浸透95%乙醇的干净吸水纸轻轻擦去多余硅烷(硅烷不能过量，否则影响印染效果)。(3)、用0.4mm边条装配好，再用胶带粘好，用夹子夹好以防渗漏。

(4)、将板呈40°角倾斜，按下面的比例直接混合溶液，然后用烧杯直接灌胶，或用50mL注射器注入，避免出现气泡（气泡出现，可敲击玻璃板，使之排出）。

6%变性聚丙烯酰胺凝胶贮液90mL，四甲基乙二胺(TEMED)60μL，过硫酸胺90μL。灌满后将鲨鱼梳子背面插入液面5-6mm，将板放置20°角使之聚合。在室温中约20min内聚合（注意底部不要边条，直接用胶带封，否则边条不易取出）。

3、测区产物凝胶电泳（凝胶灌制后2-24h后均可获得良好结果）

(1)、去掉凝胶两边和底部胶带纸，拔下鲨鱼齿梳并转过来用尖齿插入凝胶约1mm。将凝胶板安装到电泳仪上，在电极上、下槽都倒入1×TBE电泳缓冲液，用吸管吹洗掉梳齿形成加样孔中残留的尿素，并去掉气泡。

接稳定电源，40cm胶以1300V预电泳20-30min，是凝胶加热到60℃左右。

(2)、将G、A、T、C 4个小管，各加入3μLDNA测序反应终止液，置于沸水中煮沸2min迅速插入冰中，上样前，短暂离心混匀。

(3)、关闭电源，上样4μL。

(4)、上样后，继续电泳，直至二甲苯蓝染料距离玻璃板底部2cm时，终止电泳。

4、DNA测序凝胶的银染法处理

(1)、玻璃板的分离：电泳结束后，小心揭开玻璃板，凝胶应牢牢黏附在短板上。

(2)、凝胶的固定：将凝胶连同放入磁盘中，加入固定液，注意要没过凝胶，放置20min直至溴酚蓝和二甲苯蓝的颜色消失。缓缓水平摇动。固定液可回收做定影液。

(3)、洗胶：用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2min。漂洗时轻轻摇动，每次前都将胶沥干10-20s。

(4)、凝胶的染色：加入染色液缓缓摇动染色30min（25min后可在另一瓷盘中备好显影液，同时要预冷到10℃）。

(5)、凝胶的漂洗：由于这一步非常关键，所以操作一定要非常快。将染色液倒入一个容器内，将瓷盘用双蒸水涮一下，然后倒入3L双蒸水，将凝胶浸入，然后将凝胶立即放入准备好的预冷显影液中（从胶浸入双蒸水到放入显影液不能超过5-10s，如超过则重复（4）（5）步）。

(6)、凝胶的显影：缓缓摇动，直到凝胶上显条带，一般为5-6min，时间不要过长，否则背景会过深（边摇动，边观察，棕褐色条带到一定强度后，马上终止）。

(7)、终止显影：将等体积定影液直接加入显影液，缓缓摇动2-3min（时间过长会使染色变淡）。

(8)、凝胶的漂洗：用双蒸水漂洗2次，每次2min。

(9)、将凝胶放在空气中干燥，识读序列。

4、BLAST比对、鉴定属、种

5、进化树的绘制