关于生物技术综合实验报告

篇一：四川大学-生物技术-综合实验报告-学生版

生物技术综合实验

甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达

学生： 学号：

同实验者：

<研究背景>

谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。

实验一 甘薯叶片RNA提取

一、实验目的

1. 了解真核生物RNA提取的原理；

2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。

二、实验原理

Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。

三、实验材料

1. 材料

甘薯（Ipomoea batatas Lam）叶片，品种为徐薯18

2. 试剂

① 无RNA酶灭菌水：加入0.01%的DEPC，处理过夜后高压灭菌；

② Trizol试剂；

③ 氯仿；

④ 异丙醇、75％乙醇；

⑤ TBE缓冲液；

⑥ 上样缓冲液（6×）

3. 仪器

高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、1.5mL塑料离心管、枪头和EP管架

四、实验方法

1. 将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物叶片加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min，使样品充分裂解；

2. 每1 mL Trizol试剂加入200 μL氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相；

3. 4℃ 12,000 rpm 离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min；

4. 4℃ 12,000 rpm 离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底；

5. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇（用RNase-free水配制），温和震荡离心管，悬浮沉淀； 4℃ 8,000 rpm离心2 min，弃上清；

6. 室温放置10 min晾干沉淀；

7. 沉淀中加入20μL RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存；

8. 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。

五、实验结果

1. RNA提取结果

依照Trizol 试剂盒方法，提出的RNA较少，此部分未以图或数据显示。

2. RNA后电泳结果

如图1. 其中9a为本组实验结果。由图可知RNA条带非常模糊，拖尾现象严重，几乎无法分清具体条带，亮度较大。点样孔附近的红色部分为杂质，在提取过程中并未很好除去。

图1. RNA提取跑胶结果。其中1泳道为样品Marker，9a泳道为本小组RNA样品。与标准对照可见条带模糊，拖尾现象严重。

六、分析与讨论

1. RNA的提取

产量并不多，可能是因裂解样品不充分或RNA沉淀未完全溶解所致。在实验过程中，由于对操作时间的掌握不熟练、操作技巧不完善，留上清与弃上清时令RNA损失了部分，使最终RNA产量不理想。

2. RNA电泳结果

有EB存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应看得很清楚，另出现条由tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊、迁移较快的带。如果

RNA没有降解，则28S rRNA的亮度应为18S rRNA的2倍，且这两条带都无弥散现象发生。由图1. 9a可知，RNA拖尾现象严重，说明RNA已大部分被降解；此外点样孔附近出现红色部分杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，同样影响RNA电泳结果。

在进行实验时，本小组成员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源

RNAase进入样品，导致其降解严重。另外，提取出RNA后本小组未立即将样品放入-70℃保存，也为导致结果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分层的过程中，由于水相吸取过多，掺杂入部分蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽，RNA条带拖尾严重可能还受该蛋白质影响。

七、总结：

本次试验RNA提取非常失败，从跑胶结果可见其降解严重。虽然大实验无法避免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质量也会影响实验结果，但从图

1. 2a，3a，2b等条带较为清晰的小组实验结果可知，琼脂糖凝胶质量以及试剂对结果干扰不大。那么本小组成员在提取过程中的操作一定出现了很大失误。首先口罩、手套应该严格按规定佩戴，提取过程对移液枪等仪器使用需谨慎仔细，尽量避免混入杂质。其次为排除部分杂质影响可对RNA样品用紫外线分光光度计测定吸光值检验，将有助于结果分析。最后，细节决定成败，我们应汲取教训避免接下来的实验出现类似问题。

实验二 第1链cDNA的合成和模板的验证

一、实验目的

1. 掌握第1链cDNA的合成方法和步骤

二、实验原理

真核生物基因多为断裂基因，编码区不连续，需经转录后加工才能成为成熟mRNA。以真核成熟mRNA为模板合成cDNA，进而获得有连续氨基酸编码的DNA序列，无需转录后加工，即可在原核细胞中表达。

真核生物的mRNA都有PolyA尾巴。引物：Oligo dT（12-18个T）。莫洛尼

氏鼠白血病毒逆转录酶（M-MLV ）以单链RNA为模板，在引物的引发下合成与模板互补的DNA链（cDNA）。

mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。

三、实验材料

1. 材料

徐薯18叶片RNA样品

2. 试剂

① dNTP mixture（10 mM each）；

② Oligo (dT) Primer (10 μM)；

③ Total RNA；

④ RNase free ddH2O；

⑤ M-MLV 反转录酶；

⑥ 5×First-strand Buffer；

⑦ 0.1 M DTT；

⑧ Ribonuclease Inhibitor (40 U/μL)

3. 仪器

10μL 和100μL 的移液枪、0.5mL的EP管、PCR仪等

四、实验方法

1. 在RNase free Microtube 管中配制下列混合液：

dNTP mixture（10 mM each）1 μL

*Oligo (dT) Primer (10 μM) 4 μL

Total RNA2 μL

篇二：生物技术综合实验报告(原生质体相关)

生物技术综合实验报告 （第一部分）

实验一 工作液的配制、培养基配制、器皿洗涤及灭菌

一、实验目的

掌握各种工作液配制方法；了解植物培养基的构成及配制方法；掌握高温高压灭菌的方法。

二、原理

培养基是植物组织培养的基本条件，同时也是关键因素。

湿热条件(121℃的蒸汽，10分钟)能够有效地杀灭附着在玻璃器皿、器具以及溶液和培养基中的微生物达到灭菌的目的。

三、器具和试剂

灭菌锅，天平，电炉，微波炉，三角瓶，封口膜，移液管，移液器，量筒，烧杯，pH试纸，培养皿，滤纸，Parafilm封口膜。

琼脂，MS培养基大量元素，无菌水，葡萄糖，2, 4-D，IBA，KT （激动素），1M NaOH及HCl，卡那霉素，头孢霉素，乙酰丁香酮 。

四、 实验内容

PH调节剂的配制、培养基母液的配制、培养基的配制、各种相关物品的准备

（一）培养基的配制步骤

1、取个干净烧杯，加入1/3-2/3左右的蒸馏水，用移液管取所需的母液加入烧杯。

2、称取定量的蔗糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容。

3、用NaOH或者 稀HCL调剂酸碱值。

4、称取定量琼脂糖加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装。

5、高压灭菌（121℃,15min-20min)。

6、冷却，取出，备用。

（二）棉花无菌苗培养基的制备

1、取25 ml MS大量元素母液，称取葡萄糖15g、于1升的烧杯中，定容后调pH值为6.0，加入7.5g/l 琼脂煮沸。

2、然后将其分装到100毫升的三角瓶中，每瓶40毫升。

3、用封口膜封口后在灭菌锅中灭菌15分钟。

4、灭菌后?于水平的工作台上冷却即可。

要求：配制 1L

（三）拟南芥无菌苗培养基的制备

1、拟南芥无菌苗培养基：1/2 MS大量元素+蔗糖10g/L，PH值6.0；加入7.5g琼脂高温高压灭菌。

2、0.1%琼脂糖：0.1g琼脂糖/100ml 蒸馏水；无菌苗培养基和0.1%琼脂糖均121°高压灭菌15分钟。

3、另准备20套9cm培养皿，灭菌。

要求：配制0.5L，装1瓶灭菌，灭菌后培养基倒皿。

五、注意事项

1、为了尽量减少人为的误差，必须严格按实验步骤进行操作，严格按照要求的量来配制工作液、母液及培养基。

2、应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。

3、所有装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养皿等都应当清楚地做上标记。

4、每小组的操作的具体事项请参照黑板上贴的任务分组。

5、爱护实验仪器及耗材，小心使用玻璃器皿，合理灭菌，因为灭菌耗时较长。

实验二 无菌苗的制备

一、原理

化学灭菌：0.1%升汞(Hgcl2)溶液浸泡10分钟可以对棉花种子等外植体进行灭菌，84消毒液（2%的次氯酸钠）浸泡3分钟可以对拟南芥等小种子外植体进行消毒。 物理消毒：紫外灯消毒、酒精灯火焰或高温烧灼5min左右可有效杀死镊子、剪刀等不锈钢操作器具的菌类达到消毒的目的。

二、实验材料、器具和试剂

棉花品种YZ1;拟南芥col-0野生型 灭菌锅，天平，电炉，三角瓶，封口膜，镊子，酒精灯，剪刀，移液管，超净工作台。

0.1%升汞溶液，84消毒液，75%酒精

三、实验内容

（一）拟南芥无菌苗培养基倒皿

1. 取上次灭菌好的拟南芥培养基（500ml装），稍微拧松瓶盖，微波炉煮沸，边煮边摇动，至全部融化。

2. 将上次灭菌好的9cm培养皿分开放?超净工作台（超净工作台需先打开）上。

3. 将融化好的培养基分装于培养皿中（500ml/18-20皿），将皿至于超净台上吹干.。

（二）共培养培养基的配制

成分数量 成分 数量

MS大量元素 (20倍） 50 ml 2,4-D (0.1mg/ ml)1 ml

NH4NO3 (20倍) 50 ml 甘氨酸(1000倍)1 ml

微量元素 (100倍)10 ml KT(0.1mg/ml)1 ml

铁盐 (100倍) 10 ml 葡萄糖 30g/L

微生素(1000倍) 1 mlPH值5.85-5.90 肌醇 (100倍) 1 ml

依次加入上述物质，调PH值5.85-5.90，然后分装至2个500ml蓝盖瓶，每瓶加入4g琼脂，灭菌，灭菌后倒皿。

（三）选择培养基的`配制

共培养培养基 +卡那霉素50mg/L + 头孢霉素400 mg/L

灭菌后，待培养基凉至60度左右加入，混匀，倒皿。

（四）棉花无菌苗的制备

1、将棉籽用手术剪刀去壳（每人3颗，饱满无病虫害种子）。

2、用0.1%的升汞灭菌13分钟。

3、无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中。

4、28℃条件下暗培养7天 （304培养箱）。

（五）拟南芥无菌苗的制备

大量法灭菌：将拟南芥种子放入1.5ml离心管中，加入84消毒液：无菌水=1:1的混合液1ml，上下摇晃灭菌2min，弃消毒液；加入1ml 75%的酒精混匀1min，然后无菌水清洗4次；加入0.1%琼脂糖溶液悬浮种子，用移液枪涂布于拟南芥无菌苗培养基，

吹干，封口。弱光培养两天至种子萌发，转至光照培养室培养两周（304培养箱）。

五、注意事项

所有操作（除数种子）均在超净工作台上进行。

六、实验结果

一周后观察无菌苗的生长状况

1、六瓶接种的棉花无菌苗中有一瓶被轻度污染，其余五瓶生长状况良好。2、拟南芥的无菌苗因涂布不均匀长势一般，幼苗较其他小组要弱小，叶片颜色较深。

实验三 愈伤组织的诱导及农杆菌介导的棉花遗传转化

一、实验目的

掌握植物体细胞胚胎发生的基本理论；了解植物愈伤组织在诱导和分化过程中的形态学、细胞学特征；进一步巩固植物离体培养和无菌操作的步骤；掌握植物遗传转化的方法、理论；掌握根癌农杆菌介导的植物遗传转化技术。

二、实验原理

植物细胞全能性：植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。

愈伤组织：

胚性愈伤：呈淡黄色或者黄绿色，质地较均匀；细胞球状或近球状，细胞核大，细胞质浓

非胚性愈伤：呈褐色、白色粉末状或白色、绿色坚硬块状 ；细胞一般为长柱状等非规则形状，细胞核小，细胞质较稀 。

农杆菌介导转基因的原理：植物细胞在受伤后，创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达，导致T-DNA被剪切，加工，形成T-链蛋白复合体（T-复合体），通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进入植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。

三、材料与用品

1、实验材料：棉花材料YZ1（上周做的无菌苗）、农杆菌菌株LBA4404。

2、用具： 超净工作台， 显微镜，载玻片，天平，三角瓶，封口膜，橡皮筋，镊子，酒精灯，培养皿，滤纸，剪刀，医用手术刀，摇床。

3、药品：诱导、共培养培养基，卡宝品红染色液，MGL活化培养基，LB培养基，乙酰丁香酮（AS）。

四、实验步骤

（一）棉花愈伤组织的诱导及观察

1、愈伤诱导培养基的配制（第1周已做）

2、无菌苗的制备

3、无菌苗的切取：选取培养7天左右健壮的无菌苗?于垫有滤纸的培养皿上，用解剖刀切掉子叶及生长点，切掉胚根及相连的约1/4的下胚轴，余下的下胚轴用作愈伤组织诱导的外植体，用解剖刀将下胚轴切成～0.7cm小段。

4、外植体接种及离体培养：将切离好的外植体接种于愈伤诱导培养基上（每瓶约7段），平行放?，28℃光照培养，每天14小时光照，进行愈伤组织诱导及增殖培养。

5、愈伤组织继代（一个月后）：待培养一个月左右，将增殖后的愈伤组织连同下胚轴切断继代到分化培养基上，进行胚性愈伤组织的分化。

6、愈伤组织形态观察：分别挑取少量非胚性愈伤和胚性愈伤组织，?于载玻片上，滴几滴清水用镊子捣碎愈伤组织，然后滴加一滴卡宝品红染色数秒钟后，在显微镜下观察比较两者细胞学特征。

（二）农杆菌介导的棉花下胚轴的遗传转化

1、共培养及选择培培养基的配制（第2周已做，没倒皿的组倒皿）

2、无菌苗的制备（第2周已做）

3、农杆菌的活化（研究生帮忙做）：从超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化；按1:100的体积加入20ml LB液体培养基里摇菌，28℃暗培养36-48hr；将浑浊的农杆菌液涂布于LB平皿上，28℃暗培养36-48hr；把培养基表面菌落刮入装有20ml MGL培养基的三角瓶中（按1/1000比例加入AS），28℃、200rpm摇30min；OD值在0.5-1.5之间（估计）即可用于侵染。

4、下胚轴与农杆菌共培养：把无菌苗切成~7mm茎段（同诱导程序），用镊子夹到经活化的菌液中进行侵染，摇匀，侵染10分钟；倒掉菌液，将下胚轴转入装有滤纸的灭菌培养皿中，吹5分钟使表面稍为干燥；再将下胚轴分散布于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21℃, 暗培养48-60小时结束共培养。

5、选择培养（48-60小时后）：把经过共培养的下胚轴用镊子转入选择培养基中，培养30天左右继代一次转入相同的选择培养基中。

五、注意事项

1、在切无菌苗时，一定要使用锋利的刀片,尽量做到一刀能切断，避免挤压茎段。

2、无菌苗培养时间不宜过长（培养七天最好）。

3、从超低温冰箱内取出的甘油管，应尽量减少其在冰箱外的时间，用完后尽快放回冰箱。

4、侵染时下胚轴稍为干燥可以增加农杆菌的吸附。

5、共培养后第一次进行选择培养时应尽量使培养的环境保持干燥，可以减少农杆菌的污染。

6、整个过程均为无菌操作环境。

六、实验结果：

1．锥形瓶与平皿中的下胚轴生长状况均良好，观察到平皿中农杆菌介导转化的下胚轴有发黑的现象，而锥形瓶中诱导的愈伤组织则无发黑现象。

2．两个平皿中的拟南芥均生长缓慢且幼叶发黄，推测原因可能与杂菌感染有关。

篇三：生物技术制药综合实验报告

生物技术制药实验报告

人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的

表达与纯

第一节引言

1.1表皮生长因子(EGF)概述

生长因子在人体中的信号传导部分起着关键的作用，它可通过与细胞表面的蛋白质受体结合，参与细胞的各种生命活动。生长因子可以是维生素，碱基，多肽等。所研究的表皮生长因子，就是一种人机体细胞合成的一种多肽。在生物体内，每个细胞的生长状态不同，在不同组织中的细胞的表皮生长因子参与生长、增值、死亡等过程。

目前，表皮生长因子已得到广泛应用。在许多公司已经开始研发甚至是生产出EGF，多种疾病的诱发原因很多，我们可以用EGF来进行详细的诊断。之后致病的查出原因，给病人减少心理的压力，带来一线生机。在经过强烈的光刺激后，尤其是激光，人们的眼部会有很大的损伤，最严重的就是眼角膜损伤，无法修复。人体在经过紫外线的照射下皮肤的损伤以及高温、蒸气、火等造成的皮肤大面积与原来的不一样的皮肤。对于这些伤害，我们可使用含有可促进人体表皮细胞的新陈代谢EGF的药膏或者是化妆品，使皮肤变得如初。

在最早研究表皮生长因子的时候就只是证明是多肽，还没有命名。是由Cohen在1960年，在提取神经生长因子时，意外发现除此种物质以外的一种多肽[2]。多个科学家对其充满好奇心，在之后的十年内，Savage真正的研究清楚，命名此种多肽为表皮生长因子。

1.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质

不同的生物中，表皮生长因子的蛋白一级结构不同。研究表明家族成员一般在多于50个氨基酸，而少于80个氨基酸，与我们所熟悉的胰岛素一样，表皮生长因子是由前体加工成的成熟的多肽，在具有生物活性[4]。如人体中的表皮生长因子是由53个氨基酸组成。

整个hEGF分子由两个结构域组成。残基1～33，形成N一端结构域；34～53为C一端结构域；成熟hEGF的序列位于单链多肽的C一末端附近，由53个氨基酸残基组成，并且其C一端和N一端分别由Arg／Asp ／Arg／His邻接，故

成熟的EGF分子，可以经专一性Arg内肽酶的作用，从前体释放[6]。二级结构上存在着反平行β片层结构是EGF骨架的常见结构，N一端和C一端在整个三维结构中不会发生什么变动，维持此结构的是由三个二硫键[7]（由于6个半胱氨酸的存在），因此分子在一定的条件下生物活性表现“顽强”[8]。我们知道同一种酶在不同的生物中有不同的生物效应，同时不同的酶在不同的生物中会有相同的生物效应，hEGF也会有此种现象。hEGF-β和hEGF-γ是hEGF的两种形式，在分子结构和同源性中相似度高，在蛋白中一级结构中即使是在C末端的某个位置上仅仅只有一个Arg的差别，当它们作用于不同细胞中的同一个受体，在生物体中的作用是一样的[9]。

与许多古细菌中的酶一样如生活在温泉中古细菌，人体表皮生长因子在100℃煮沸达到30 min，仍然能保持结构、活性等稳定性；许多蛋白质在具有强列的催化效率的酶如胰蛋白酶作用下肽链被断掉，而表皮生长因子耐它的消化。EGF在狭小的活性微环境中，由于常见的丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸[11]会提供作用基团，表皮生长因子才能与受体结合反应。多肽具有N端和C端，有的在生物活性中不起作用，有的是至少有一段起作用，据研究表明，表皮生长因子结构的两端在细胞的生长中都很重要。

1.3 EGF的生物学效应及应用

细胞通过在信号传导的过程中有多种方式包括直接或间接的接触。自分泌或旁分泌是hEGF作用的方式，在生物体内它亦可以与其他的因子结合作用于细胞。EGF生物效应很多，如下所述：

1.来源于人体的不同种组织的上皮细胞为了适应人体的需要，从基因上赋予它很高分裂效率。EGF在其中起着关键性的作用。首先人体的皮肤表层会产生脱皮现象，证明有大量的细胞死亡。同样，皮肤的表面受到伤害在愈合的过程会结痂，新的皮肤又长出来了。EGF在创伤修复中起着功不可没的作用，在肝脏、肠道、角膜、胃等多种组织创伤的恢复的试验研究[12]取得重大的突破，在临床上已经运用于烧伤、烫伤、创伤及外科手术伤口的愈合，使病人的痛苦少一点。