论药品微生物检测实验室的建立论文

微生物污染是药品质量评估的重要指标，目前各国药典收录的药品无菌检查和微生物限度检查方法只对药品终产品质量进行评价，且对无菌检查不合格的药品要求不得进行复验。药品微生物检测实验室如缺少对实验环境的监督和控制，则无法评估微生物阳性结果的污染来源。而药品检测过程中的微生物阳性结果可能源于实验过程中环境的污染，因此判断检出菌与环境菌的相关性，是排除实验过程污染、减少假阳性结果、提高检验结果准确性的必不可少的环节。同时现阶段药品安全管理仍存在监管漏洞，当药品受到致病微生物污染时，往往出现定溯源难、应变慢等问题。若建立微生物检测实验室日常的环境微生物菌库，则可较好地解决上述问题。目前国外通过分子生物学手段对病原微生物建库的研究较多，如RIDOM website 提供根据16S DNA 序列的差异建立的病原微生物库[4]。国内对制药环境建立环境微生物菌库相关方面的研究也有报道，如PEI等[5]曾采用FTIR 法构建洁净室环境菌的FTIR 谱库，但该方法对微生物的培养条件及预处理要求严格，随机误差也较大。目前在药品微生物检测实验室建立环境微生物菌库方面的研究仍较少。本研究从笔者工作的药品微生物检测实验室环境中不同部位、设备材料及活动人员进行连续7个月采样收集微生物，共获得248 株细菌和6 株霉菌，对收集的细菌采用全自动微生物生化鉴定仪(Vitek2 Compact)进行鉴定，对生化鉴定无确切结果的90 株细菌及6 株霉菌均采用3500 MicroSeq基因测序分析系统进行细菌16S rDNA 和霉菌LSU rDNA 测序鉴定，并对某次采样收集获得的6株金黄色葡萄球菌采用Diversilab 进行同源性分析。通过对鉴定结果的整理和分析，初步建立了药品微生物检测实验室环境微生物库，为今后本实验室微生物检测结果污染溯源调查提供了信息保障，同时也为制药企业开展建立环境微生物信息库和微生物污染溯源提供了技术指导。

　　1 材料与方法

1.1 仪器与试剂光学显微镜( 日本奥林巴斯) ; VITEK 2Compact 全自动微生物生化仪、全自动革兰氏染色仪、Diversilab 同源性分析系统(法国梅里埃);梯度96 孔Verti PCR 仪(美国ABI 公司);PowerpacBasic 电泳仪(美国Bio-Rad 公司);3500 MicroSeq全自动微生物基因分析鉴定系统(美国ABI 公司)。

1.2 环境微生物的`收集连续7 个月对微生物实验室环境中不同部位、活动人员及设备材料采用胰蛋白胨大豆琼脂(广东环凯)平板，分别通过接触碟法(人员身上取样)、浮游菌采样器(环境浮游微生物取样)、空气沉降法(环境沉降微生物取样)及棉签擦拭法(设备和材料表面取样)进行微生物样本采集，分离纯化后共获得248 株细菌和6 株霉菌，采用甘油冻存管置?70 ℃冰箱保存。

1.3 生化鉴定采用VITEK 2 Compact 对获得的248 株细菌的新鲜培养物根据革兰染色镜检结果选取GN、GP、BCL 不同鉴定试剂卡进行生化鉴定。

1.4 细菌16S rDNA 及霉菌LSU rDNA 测序鉴定对VITEK 鉴定无确切鉴定结果的90 株细菌及6 株霉菌分别采用3500 MicroSeq 全自动微生物基因分析鉴定系统进行细菌16S rDNA 和霉菌LSU rDNA 测序鉴定。采用3500 MicroSeq 系统配套试剂对90 株细菌和6 株霉菌的TSA 平板培养物分别进行DNA 抽提、PCR 扩增和纯化、标记反应及标记反应纯化，最后进行毛细管电泳测序。

1.5 6 株金黄色葡萄球菌的Diversilab 同源性分析某次采样收集到6 株菌，采用VITEK 生化鉴定和16S rDNA 测序鉴定结果均为金黄色葡萄球菌，且在所测16S rDNA 基因片段中序列完全相同。为进一步获得6 株菌的分型信息，采用基于重复序列扩增技术的Diversilab 同源性分析系统进行实验。对6 株菌分别采用DiversiLab 仪器配套的金黄色葡萄球菌的rep-PCR 扩增试剂盒先进行扩增，后吸取1 ?L PCR 产物加入芯片的标本孔，进行电泳分离扩增的DNA的片段，采用仪器自带软件绘制基因分型同源性关系图。

　　2 结果

2.1 菌株来源统计本次建库收集到环境微生物分离菌株共计254 株，包括248 株细菌和6 株霉菌，所有的霉菌均来源于沉降菌收集。大部分菌株均来源于在微生物实验室活动的人员(137 株)，占全部分离菌株的53.9%。其余环境沉降微生物(30 株)、环境浮游微生物(47 株)及来源于设备和材料表面的微生物(40 株)占全部分离菌株比例相差不大，分别为11.8%，18.5%和15.7%。

2.2 环境微生物菌库的建立结合生化鉴定和测序鉴定结果的254 株微生物的鉴定结果统计见表1。其中葡萄球菌属细菌最多，占全部分离菌的34.3%;其次为芽孢杆菌和微球菌，分别占全部分离菌的32.7%和12.6%。环境沉降菌和空气浮游菌共收集到77 株微生物，占污染微生物总数的30.3%。其中，芽孢杆菌、葡萄球菌和藤黄微球菌均为常见环境菌。从设备材料和操作人员共收集分离表面微生物177 株，占污染微生物总数的69.7%。污染微生物比例最高的分别为芽孢杆菌属、藤黄微球菌和表皮葡萄球菌，分别占表面微生物总数的29.9%、15.8%和14.1%。采用生化鉴定和测序鉴定2 种方法对微生物实验室环境中收集到的254 株菌进行鉴定，通过鉴定结果的整理和分析，初步建立了药品微生物检测实验室环境微生物库。

2.3 6 株金黄色葡萄球菌的同源性分析结果6 株金黄色葡萄球菌采用Diversilab 系统进行同源性分析，实验结果显示6 株金黄色葡萄球菌高度同源，最低菌株间的亲缘关系也达到99%(亲缘关系>95%，即为同源)，所以6 株菌应该来自同一个污染源。

　　3 讨论

从建立的环境微生物库各方面的对比情况分析可知，大部分微生物均来源于微生物实验室中活动的人员。葡萄球菌属和微球菌属细菌为人体易携带污染的微生物，这两类微生物在多个采样点均有发现，所以可能是由于人员活动或表面接触带来的交叉污染，表明操作人员携带的微生物是实验室环境菌的主要来源之一，为了减少污染应严格控制人员的更衣和清洁程序。环境中同样存在着多种芽孢杆菌，在环境中不易被消毒灭菌，可能是由于消毒频次和消毒剂效力问题导致的残留污染，应该增加消毒灭菌频率并有计划地更换消毒剂确保杜绝污染。本研究通过7 个月的持续采样收集环境微生物，初步建立了药品微生物检测实验室的环境微生物库，但是环境微生物库的建立是个持续动态的过程，因此需要在日常监测中不断完善。本次建库采用微生物鉴定(生化鉴定和测序鉴定)和分型技术(Diversilab 同源性分析系统)对微生物实验室进行监控，建立和健全了日常监督检查方法，为今后开展污染水平的风险评估和不良事件调查提供技术平台，同时也为高风险药品生产企业建立环境微生物数据库提供技术指导。