关于微生物氮的介绍

微生物氮篇一：微生物和氮素循环

第九章

在自然界，生物不断地从环境中吸收它们生长发育所必需的C、H、O、N、S、P等各种营养元素。但是，这些营养元素在自然界的总量是有限的，而生命的延续是无限的，只有这些元素的循环使用，生物界不断向前发展。促进这些物质循环的作用有物理作用、化学作用和生物作用，其中生物是起主导作用的，而微生物是自然界物质循环的主要推动者，在自然界物质循环中起着非常重要的作用。本文主要介绍了微生物在氮素循环中的作用。

关键词：固氮氨化硝化同化反硝化

2微生物在氮素循环中的作用

氮是核酸和蛋白质的主要成分，是构成生物体的必需元素。虽然占大气体积78%的气体是N2，但所有动植物和大多数微生物都不能直接利用N2。作为自然界最重要的初级生产者的植物所需要的氮?铵盐、硝酸盐等无机氮化物，在自然界为数不多，只有将大气中的N2进行转化和循环，才能满足植物体对氮素的需要。氮素循环包括微生物的固氮作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用以及同化作用，这其中的每一种作用都离不开微生物的参与。

2.1固氮作用

分子态氮被还原成氨或其它氮化物的过程称为固氮作用。自然界氮的固定有两种方式，一是非生物固氮，即通过雷电、火山爆发和电离辐射等固氮以及人工合成氨，非生物固氮形成的氮化物在数量上远不能满足自然界生物生长的需要；二是

生物固氮，即通过微生物的作用固氮，自然界生物生长所需要的氮大部分通过这种作用提供。生物固氮不仅经济，而且不破坏环境，在N2的转化中占有重要地位。湖水沉积物中含有大量的固氮菌(Peptea,1993)，能够固氮的微生物均为原核生物，主要有细菌、放线菌和蓝细菌(徐孝华,1991)。

2.2氨化作用

微生物分解含氮有机物产生氨的过程称为氨化作用。氨化作用在农业生产中十分重要，施入土壤中的各种动植物残体和有机肥，包括绿肥、堆肥和厩肥都含有丰富的.含氮有机物。这些有机物须通过各类微生物的作用，将其氨化后才能被植物吸收和利用。水中的氨化细菌有助于水体中氮的循环和水的清洁，湖的底泥中氨化细菌相当活跃(Genovese,1994)。

2.3硝化作用

微生物将氨氧化成硝酸盐的过程称为硝化作用。硝化作用是自然界氮素循环中不可缺少的一环。硝化作用分两个阶段进行，每个阶段都离不开微生物的作用。第一阶段是氨在亚硝化细菌的作用下被氧化为亚硝酸盐。第二阶段是亚硝酸盐在硝化细菌的作用下被氧化为硝酸盐。土壤中固氮细菌的数量多于硝化细菌(金钧然,1991)。

2.4同化作用

铵盐和硝酸盐是植物和微生物良好的无机氮类营养物质，它们可被植物和微生物吸收利用，合成氨基酸、蛋白质、核酸和其它含氮有机物。湖泊中具有同化作用的细菌有助于淡水鱼对蛋白质的利用(Shivokene,1996)。

2.5反硝化作用

微生物还原硝酸盐，释放出分子态氮和/或N2O的过程称为反硝化作用或脱氮作

用。反硝化作用是造成土壤氮素损失的重要原因之一。反硝化作用一般只在厌氧条件下进行，在农业生产上常采用中耕松土的办法抑制反硝化作用。从整个氮素循环来说，反硝化作用是有利的。水体中的反硝化细菌有助于碳的循环(宋金明,2000)。湖水沉积物中含有大量的反硝化细菌，如果没有反硝化作用，自然界的氮素循环就会被中断，硝酸盐将会在水体中大量蓄积，对人类的健康和水生生物的生存就会造成极大的威胁(Peptea,1998)。

微生物氮篇二：凯氏定氮法：土壤微生物量氮测定

土壤微生物量氮的测定方法

1.试剂配制：

(1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。

(2)密度为1.84浓硫酸。

(3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶解定容至1L。

(4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体积比100:2加入混合指示剂）

(5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中,用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。

(6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至1000ml，用基准物质标定之。

(7)0.5MK2SO4溶液：称取K2SO487.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加热）定容至1L。

(8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl210g，置于暗处保存。

2.试验步骤：。

（1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5MK2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5MK2SO4=1：2)，加入0.5MK2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5MK2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。

（2）测定：滤液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存，此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至

溶液呈清彻淡蓝色，然后继续消煮0.5—1.0h，最后溶液呈蓝绿色，土呈灰白色，全部消煮时间约85一90min。消煮完毕冷却，同时做两个试剂空白试验。

（3）计算：

A．氮含量计算

土壤含氮量（%）=(V-V0)*N*0.014*100*ts/W

V-滴定试样时消耗的盐酸标准溶液体积，ml。

V0-滴定空白时消耗的盐酸标准溶液体积，ml。

N-盐酸标准溶液的当量浓度。（此处为0.01）

W-土壤样品重（用水分系数换算成烘干土重）g。

0.014-氮的毫克当量

ts为分取倍数，滤液为30ml，试验测定用了10ml，因此处ts为3

B．微生物氮计算

B(N)=EN／KEN

式中B(N)——微生物量氮（BN）质量分数，-1；

EN——熏蒸土样浸提的全N与未熏蒸土样之间的差值，-1；（取上述A熏蒸和未熏蒸全氮的差值）

KEN—代表被氯仿熏蒸杀死的土壤微生物生物量碳在培养期间矿化为矿质态氮的比例，常取0.57（Jenkinson.1988）

注：所有的滤液测定参考的方法为：陈立新《土壤实验实习教程》，步骤和熏蒸前期处理参考：吴金水《土壤微生物生物量测定方法及其应用》，所有的药品全是分析纯，若土壤比较贫瘠可在消煮的时候加多点浸提液。

微生物氮篇三：土壤微生物量碳氮的测定

土壤微生物量的测定

一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取－碳自动分析法）

1、试剂配制

（1）去乙醇氯仿制备：市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，所以，使用前必须将其中的乙醇去掉。方法是量取适量的分析纯氯仿，按1?2（v:v）的比例与蒸馏水或去离子水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。

（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）=1molL-1]

（3）硫酸钾浸提剂[c（K2SO4）=0.5molL-1]：取1742.6g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末装，倒于25L塑料桶中，加蒸馏水至20L，盖紧螺旋盖置于摇床（150rmin-1），溶解24h。

（4）六偏磷酸钠溶液（5%，pH2.0）：50.0g分析纯六偏磷酸钠溶于800ml双蒸水，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，再用双蒸水定容至1L。注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制，且由于其易粘于烧杯底部，加热时常因受热不均使烧杯破裂。

（5）过硫酸钾溶液（2%）：20.0g分析纯过硫酸钾溶于双蒸水，定容至1L。注意：过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放，使用期最多为7d。

（6）磷酸溶液（21%）：37ml85%分析纯浓磷酸与188ml双蒸水混合。

（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）=1000mgCL-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前先经105℃烘2～3h），溶于双蒸水，定容至1L。

2、仪器设备

碳?自动分析仪（Phoenix8000）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6?1）或无油真空泵、pH?自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST?3）、烧杯（25、50、80ml）。

3、操作步骤

（1）土壤前处理

新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土壤中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径<2mm）并混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，并经常翻动，以避免局部干燥，至土壤含水量约为田间持水量（Water-holdingcapacity，WHC）的40%（以手感湿润疏松但不结块为宜）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节含水量至田间持水量的40%。将土壤置于密封的塑料桶内，在25℃下预培养7～15d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1molL-1NaOH溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。这些过程是为了消除土壤水分限制对微生物的影响，以及植物残体对测定的干扰。经预培养的土壤应立即分析，否则，应置于4℃下保存，但分析前需在上述条件下至少再培养24h。

（2）熏蒸

称取经前处理相当于50.0g烘干基的新鲜土壤3份，置于80ml烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3个，烧杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（0.5mm大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的颗粒，同时放入一小烧杯稀NaOH溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2，干燥器底部还应加入少量水以保持湿度。用熏蒸抽真空装置（也可采用无油真空泵，如DOA-P181-BN型真空/正压泵）抽真空，在?0.07MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾3～5min。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下熏蒸24h。打开干燥器阀门时，由于空气进入应该有明显的声音；否则，意味着抽真空不够或漏气，应重新进行熏蒸。

取出土壤和氯仿（氯仿到回贮存瓶，可再使用），将装土壤的烧杯转入清洁真空干燥器，同上反复抽真空（?0.07MPa）直到土壤无氯仿味为止；否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。一般需要反复抽真空5～6次，每次3min，每次抽真空后，最好完全打开干燥器，以加快去氯仿速度和效果。熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加入去乙醇氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为“对照”土壤。

（3）浸提

将熏蒸土壤无损地转移到200ml聚乙烯塑料瓶中，加入100ml0.5molL-1K2SO4，土水比为1:4（w:v），振荡（25℃，300rmin-1）浸提30min，用中速定量滤纸过滤于125ml塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份不熏蒸土壤于200ml聚乙烯浸提塑料瓶中，加入100ml0.5molL-1K2SO4同上浸提。同时做3个不加土壤的试剂空白。浸提液应立即分析，或在?18℃下保存。

（4）测定

取10ml土壤浸提液于40ml样品瓶中（注意解冻的浸提液在取样前应彻底混匀），加入10ml六偏磷酸钠溶液（pH2.0），使浸提液中的沉淀（CaSO4和K2SO4）全部溶解。采用碳?自动分析仪（Phoenix8000）测定样液有机碳含量。基本过程：先在样液中通入高纯度氮气5～10min，以除去溶解在浸提液中的部分CO2，样液再进入无机碳排除管进一步去掉残留的CO2，然后样液进入紫外氧化管，在紫外灯以及过硫酸钾溶液和磷酸溶液的作用下，浸提液中的有机碳全部氧化为CO2并释放出来，产生的CO2经一系列纯化后通过红外检测器测定。载气为高纯度氮气。详细操作步骤参见仪器使用说明。

工作曲线：分别吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml浓度为1000mgCL-1邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100ml容量瓶中，用双蒸水定容。即得0、20、40、60、80、100mgCL-1系列标准碳溶液。分别吸取上述不同浓度的标准碳溶液10ml于40ml样品瓶中，按上述相同方法测定。

（5）结果计算

土壤微生物生物量碳：BC=EC/kEC

式中：EC=熏蒸土壤浸提的有机碳?不熏蒸土壤浸提的有机碳；

kEC为转换系数，取值0.45（Wu等，1990）。

二、土壤微生物生物量氮（氯仿熏蒸－K2SO4提取－碳自动分析法）

1、试剂配制

（1）去乙醇氯仿：同上

（2）硫酸钾浸提液：同上

（3）硫酸铬钾还原剂：硫酸铬钾还原剂（5%）：50.0g分析纯硫酸铬钾，溶于200ml分析纯浓硫酸（H2SO4，ρ=1.84gml-1），用蒸馏水稀释到1L。

（4）硫酸铜溶液[c（CuSO4）=0.19molL-1]：30.324g分析纯硫酸铜（CuSO4）溶于蒸馏水，定容至1L。

（5）氢氧化钠溶液[c（NaOH）=10molL-1]：400g分析纯氢氧化钠溶于蒸馏水，定容至1L。

（6）氢氧化钠溶液[c（NaOH）=4molL-1]：160g分析纯氢氧化钠溶于双蒸水，定容至1L，过滤（<0.45μm）。

（7）氢氧化钠溶液[c（NaOH）=0.01molL-1]：2.5ml4molL-1NaOH溶液用色谱纯水稀释至1L。

（8）硼酸溶液（2%）：20.0g分析纯硼酸（H3BO4）溶于蒸馏水，定容至1L。

（9）硫酸溶液[c（H2SO4）=0.05molL-1]：28.8ml分析纯浓硫酸（H2SO4，ρ=1.84gml-1）用蒸馏水稀释定容至1L，此溶液硫酸浓度为0.5molL-1，将该溶液稀释10倍即可得到0.05molL-1硫酸溶液，再用0.1molL-1标准硼砂溶液标定其准确浓度。

（10）指示剂贮存液：1.0g氨混合指示剂溶于10ml0.01molL-1NaOH和10ml95%乙醇混合液，用双蒸水定容至200ml。此贮存液可保存1个月。

（11）指示剂溶液：10ml指示剂贮存液用双蒸水稀释定容至500ml，过滤（<0.45μm）。此溶液应使用前一天配制，最多可使用1周。

（12）氯化铵标准贮存液[ρ（NH4Cl）=1000μgNml-1]：3.8190g分析纯氯化铵（称量前经105℃烘2～3h）溶于双蒸水，并定容至1L。此贮存液可稳定保存数月。

（13）氯化铵标准溶液[ρ（NH4Cl）=50μgNml-1]：10ml1000μgNml-1氯化铵贮存液用双蒸水稀释至200ml。此溶液最多保存7d。

2、仪器设备

流动注射氮分析仪（FIAStar5000，FOSS公司）或定氮仪、pH自动滴定仪、真空抽滤瓶，微孔滤膜（<0.45μm）、容量瓶（100ml）、其他仪器设备同上。

3、操作步骤

（1）土壤前处理、熏蒸、浸提同上。

（2）消化：取10.0ml浸提液（或经还原反应后的浸提液）于250ml消化管中，加入0.2ml0.19molL-1CuSO4溶液、5ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物，混合液消化变清后再回流3h。

（3）消化液中氮的测定：消化液冷却后，用双蒸水洗涤转移到100ml容量瓶中，至体积大约为70ml，待冷却后缓慢加入10ml10molL-1NaOH溶液中和部分H2SO4，边加边充分混匀，以免因局部碱浓度过高而引起消化液中NH3的损失，再用双蒸水定容至100ml。溶液中NH4+含量采用流动注射氮分析仪（FIAStar5000型）测定。采用40μl样品圈，KTN扩散膜（耐强酸和强碱），载液为双蒸水，试剂Ⅰ为4molL-1NaOH溶液，试剂Ⅱ为指示剂溶液。校正曲线溶液制备：分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml50μgNml-1氯化铵标准溶液于100ml容量瓶中，再分别用双蒸水洗涤转移1个空白消化液于容量瓶中，其余操作步骤同样液。然后用双蒸水定容至100ml，即得浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μgNml-1系列氯化铵标准溶液，采用测定KTN方法模块测定和制备校正曲线。校正曲线溶液最少应每个月制备一次。其他具体操作参见仪器使用说明。

（6）计算

土壤微生物生物量氮：BN=EN/kEN

式中：EN=熏蒸土壤浸提测定的全氮?不熏蒸土壤浸提测定的全氮；kEC为转换系数，取值0.45。